Ein Fluoreszenzfilter ist ein wesentlicher Bestandteil eines Fluoreszenzmikroskops. Ein typisches System verfügt über drei Grundfilter: einen Anregungsfilter, einen Emissionsfilter und einen dichroitischen Spiegel. Üblicherweise sind sie in einem Würfel verpackt, so dass die Gruppe gemeinsam in das Mikroskop eingesetzt werden kann.
Wie funktioniert ein Fluoreszenzfilter?
Anregungsfilter
Anregungsfilter lassen Licht einer bestimmten Wellenlänge durch und blockieren andere Wellenlängen. Sie können verwendet werden, um verschiedene Farben zu erzeugen, indem der Filter so eingestellt wird, dass nur eine Farbe durchgelassen wird. Es gibt zwei Haupttypen der Anregungsfilter: Langpassfilter und Bandpassfilter. Der Erreger ist normalerweise ein Bandpassfilter, der nur die vom Fluorophor absorbierten Wellenlängen durchlässt, wodurch die Anregung anderer Fluoreszenzquellen minimiert und Anregungslicht im Fluoreszenzemissionsband blockiert wird. Wie die blaue Linie in der Abbildung zeigt, beträgt der Blutdruck 460–495, was bedeutet, dass er nur die Fluoreszenz von 460–495 nm passieren kann.
Es wird im Beleuchtungspfad eines Fluoreszenzmikroskops platziert und filtert alle Wellenlängen der Lichtquelle mit Ausnahme des Fluorophor-Anregungsbereichs heraus. Die Mindestdurchlässigkeit des Filters bestimmt die Helligkeit und Brillanz der Bilder. Für jeden Anregungsfilter wird eine Transmission von mindestens 40 % empfohlen, so dass die Transmission idealerweise >85 % beträgt. Die Bandbreite des Anregungsfilters sollte vollständig innerhalb des Fluorophor-Anregungsbereichs liegen, sodass die Mittenwellenlänge (CWL) des Filters so nah wie möglich an der Spitzenanregungswellenlänge des Fluorophors liegt. Die optische Dichte (OD) des Anregungsfilters bestimmt die Dunkelheit des Hintergrundbildes; OD ist ein Maß dafür, wie gut ein Filter die Wellenlängen außerhalb des Übertragungsbereichs oder der Bandbreite blockiert. Ein Mindest-OD von 3,0 wird empfohlen, ideal ist jedoch ein OD von 6,0 oder mehr.
Emissionsfilter
Emissionsfilter dienen dazu, die gewünschte Fluoreszenz der Probe zum Detektor gelangen zu lassen. Sie blockieren kürzere Wellenlängen und haben eine hohe Transmission für längere Wellenlängen. Dem Filtertyp ist auch eine Nummer zugeordnet, z. B. BA510IF in der Abbildung (Interferenzbarrierefilter), diese Bezeichnung bezieht sich auf die Wellenlänge bei 50 % seiner maximalen Transmission.
Die gleichen Empfehlungen für Anregungsfilter gelten auch für Emissionsfilter: minimale Transmission, Bandbreite, OD und CWL. Ein Emissionsfilter mit der idealen Kombination aus CWL, minimaler Transmission und OD liefert möglichst helle Bilder mit größtmöglicher Blockierung und gewährleistet die Erkennung der schwächsten Emissionssignale.
Dichroitischer Spiegel
Der dichroitische Spiegel wird in einem Winkel von 45° zwischen dem Anregungsfilter und dem Emissionsfilter platziert und reflektiert das Anregungssignal zum Fluorophor, während er das Emissionssignal zum Detektor überträgt. Ideale dichroitische Filter und Strahlteiler weisen scharfe Übergänge zwischen maximaler Reflexion und maximaler Transmission auf, mit einer Reflexion von >95 % für die Bandbreite des Anregungsfilters und einer Transmission von >90 % für die Bandbreite des Emissionsfilters. Wählen Sie den Filter unter Berücksichtigung der Schnittwellenlänge (λ) des Fluorophors aus, um Streulicht zu minimieren und das Signal-Rausch-Verhältnis des Fluoreszenzbildes zu maximieren.
Der dichroitische Spiegel in dieser Abbildung ist der DM505, der so genannt wird, weil 505 Nanometer die Wellenlänge bei 50 % der maximalen Transmission dieses Spiegels ist. Die Transmissionskurve für diesen Spiegel zeigt eine hohe Transmission über 505 nm, einen steilen Abfall der Transmission links von 505 Nanometern und ein maximales Reflexionsvermögen links von 505 Nanometern, kann aber unterhalb von 505 nm immer noch eine gewisse Transmission aufweisen.
Was ist der Unterschied zwischen Langpass- und Bandpassfiltern?
Fluoreszenzfilter können in zwei Typen unterteilt werden: Langpassfilter (LP) und Bandpassfilter (BP).
Langpassfilter lassen lange Wellenlängen durch und blockieren kürzere. Die Grenzwellenlänge ist der Wert bei 50 % der Spitzentransmission, und alle Wellenlängen oberhalb der Grenzwellenlänge werden von den Langpassfiltern durchgelassen. Sie werden häufig in dichroitischen Spiegeln und Emissionsfiltern eingesetzt. Langpassfilter sollten verwendet werden, wenn die Anwendung eine maximale Emissionssammlung erfordert und wenn eine spektrale Unterscheidung nicht wünschenswert oder notwendig ist, was im Allgemeinen bei Sonden der Fall ist, die eine einzelne emittierende Spezies in Proben mit relativ geringem Hintergrund-Autofluoreszenzniveau erzeugen.
Bandpassfilter lassen nur ein bestimmtes Wellenlängenband durch und blockieren andere. Sie reduzieren das Übersprechen, indem sie nur die Übertragung des stärksten Teils des Fluorophor-Emissionsspektrums zulassen, reduzieren das Autofluoreszenzrauschen und verbessern so das Signal-Rausch-Verhältnis in Autofluoreszenzproben mit hohem Hintergrund, was Langpassfilter nicht bieten können.
Wie viele Arten von Fluoreszenzfiltersätzen kann BestScope liefern?
Zu den gängigen Filtertypen gehören Blau-, Grün- und Ultraviolettfilter. Wie in der Tabelle gezeigt.
| Filtersatz | Anregungsfilter | Dichroitischer Spiegel | Barrierefilter | Wellenlänge der LED-Lampe | Anwendung |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: Fluoreszierende Antikörpermethode ·Säureorange: DNA, RNA ·Auramin: Tuberkelbazillus ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535 nm | ·Rhodamin, TRITC: Fluoreszierende Antikörpermethode ·Propidiumiodid: DNA ·RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | ·Autofluoreszenzbeobachtung ·DAPI: DNA-Färbung ·Hoechest 332528, 33342: Wird zur Chromosomenfärbung verwendet |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 nm | ·Katecholamine ·5-Hydroxytryptamin ·Tetracyclin: Skelett, Zähne |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Filtersätze, die bei Fluoreszenzaufnahmen verwendet werden, sind auf die wichtigsten Wellenlängen ausgelegt, die in Fluoreszenzanwendungen verwendet werden, und basieren auf den am häufigsten verwendeten Fluorophoren. Aus diesem Grund werden sie auch nach dem Fluorophor benannt, für dessen Bildgebung sie bestimmt sind, etwa DAPI- (blau), FITC- (grün) oder TRITC- (rot) Filterwürfel.
| Filtersatz | Anregungsfilter | Dichroitischer Spiegel | Barrierefilter | Wellenlänge der LED-Lampe |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 nm |
| FL-Auramin | BP470 | DM480 | BA485 | 450 nm |
| Texas-Rot | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 nm |
Wie wählt man einen Fluoreszenzfilter aus?
1. Das Prinzip der Auswahl eines Fluoreszenzfilters besteht darin, das Fluoreszenz-/Emissionslicht so weit wie möglich durch das Bildgebungsende passieren zu lassen und gleichzeitig das Anregungslicht vollständig zu blockieren, um das höchste Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen. Insbesondere bei der Anwendung von Multiphotonenanregungs- und Totalreflexionsmikroskopen führt das schwache Rauschen auch zu starken Störungen des Abbildungseffekts, sodass die Anforderungen an das Signal-Rausch-Verhältnis höher sind.
2. Kennen Sie das Anregungs- und Emissionsspektrum des Fluorophors. Um einen Fluoreszenzfiltersatz zu konstruieren, der ein qualitativ hochwertiges, kontrastreiches Bild mit schwarzem Hintergrund erzeugt, sollten Anregungs- und Emissionsfilter eine hohe Transmission mit minimaler Durchlassbandwelligkeit in den Bereichen erreichen, die den Anregungsspitzen oder Emissionen des Fluorophors entsprechen.
3. Berücksichtigen Sie die Haltbarkeit von Fluoreszenzfiltern. Diese Filter müssen undurchlässig für intensive Lichtquellen sein, die ultraviolettes (UV) Licht erzeugen, das zum „Durchbrennen“ führen könnte, insbesondere des Erregerfilters, da dieser der vollen Intensität der Beleuchtungsquelle ausgesetzt ist.
Die verschiedenen fluoreszierenden Beispielbilder
Die Ressourcen werden im Internet gesammelt und organisiert und dienen ausschließlich dem Lernen und der Kommunikation. Bei Verstößen wenden Sie sich bitte an uns, um die Löschung zu veranlassen.
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 09.12.2022